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封閉液都有哪些?怎么選擇?

 更新時(shí)間:2025-01-03    點(diǎn)擊量:106

封閉液的選擇主要基于抗體和目標(biāo)蛋白,日常內(nèi)參,還有一些本底豐度比較高的蛋白用脫脂牛奶封閉沒問題;磷酸化蛋白可采用BSA,如若豐度很低,或測上清分泌蛋白個(gè)人比較推薦使用成品快封,脫脂牛奶和BSA效果其實(shí)都不太穩(wěn)定。

?封閉液主要有以下幾種:脫脂奶粉、牛血清白蛋白BSA)、血清、明膠聚乙烯吡咯烷酮PVP)。

 

、5%脫脂牛奶

封閉時(shí)間:室溫1-2h或者4度過夜。

脫脂奶粉zui常用和便宜的封閉劑,通常使用濃度為2.5%-5%。其優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且效果良好,但缺點(diǎn)是如果目標(biāo)蛋白被磷酸化,則不應(yīng)使用脫脂奶粉,因?yàn)榕D讨械睦业鞍讜?huì)與抗磷酸化抗體結(jié)合,導(dǎo)致非特異性結(jié)合和高背景信號?

一般5%脫脂牛奶pH大約為6.0左右,有些研究稱脫脂奶粉需調(diào)PH7.4左右,但是大多數(shù)抗體不調(diào)pH也可以做出來,封閉后可采用1*TBST漂洗10分鐘再孵育一抗。

 

??注意事項(xiàng):

1、日常保存放4度,變質(zhì)析出后不要再繼續(xù)使用,配置新的5%脫脂奶粉。

2、配置新的5%脫脂奶粉時(shí)可用磁力攪拌使其充分溶解,充分溶解后再使用。

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、BSA(牛血清白蛋白)

BSA是從牛血清中提純的白蛋白,通常使用濃度為2%-5%。優(yōu)點(diǎn)是純度較高,不容易產(chǎn)生非特異性結(jié)合,適合對背景要求嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)是BSA制劑可能含有磷酸化酪氨酸,會(huì)引起抗磷酸酪氨酸抗體的高背景,且與凝集素探針不相容。

?封閉時(shí)間:室溫1h,對于一些背景非常高的抗體,可以4℃過夜。

除了脫脂奶粉之外,比較常用的封閉劑,濃度可選2-5%。

磷酸化蛋白建議采用BSA或快封,BSA效果不穩(wěn)定,如果使用BSA封閉一般,可以試試用快速封閉液。

 

、全血清

通常使用的濃度為 5-10%

使用率較低,價(jià)格昂貴。

對比脫脂奶粉和BSA也沒有什么好處,一般不選擇。但血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間的結(jié)合,BSA無法封閉Fc受體。

 

、成品快速封閉液

封閉時(shí)間很快,基本只需要10-15min即可,也有一些是需要30min。

每個(gè)成品封閉液都有自己的Protocol,基本照做就沒問題。

成品快封通常含有提純過的蛋白,這種封閉液比脫脂奶粉和BSA好的地方是里面不含有各種亂七八糟的增強(qiáng)背景的蛋白成分。

 

 

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